图2：MSBC生产PURE重组蛋白质元件。a. 大肠杆菌中蛋白质合成的核心机制需要34种酶。b. 34 种MSB单独培养产生了相应的34种酶。c. 34种MSB组成的MSBC培养产物包含相应的34种酶。d. 使用MSBC产物构建的PURE反应机器成功表达了RFP
接下来，研究人员进一步利用MSBC方法构建精准调控的跨物种群落。大肠杆菌和酿酒酵母是实验室研究和工业应用中使用最广泛的两种微生物。共培养大肠杆菌和酿酒酵母可以潜在地利用这两个宿主的优点，如大肠杆菌可以快速、大量合成蛋白质；酿酒酵母可以对复杂真核酶实现可溶性表达。然而，大肠杆菌（约20分钟）和酿酒酵母（约90-120分钟）的传代时间差异使大肠杆菌更有效地消耗营养并成为优势者。研究人员将表达红色荧光蛋白的大肠杆菌和表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母接种到培养基中进行混合共培养，然后顺利获得流式细胞仪分析它们的组成。结果表明，无论大肠杆菌初始的接种比例如何，最终都会在菌群中占据主导（图3a）。相比之下，MSBC方法可以实现两个物种的稳定培养以及成分的精准调控。科研人员第一时间构建了大肠杆菌和酿酒酵母分的MSB，并顺利获得调控两种MSB的接种比例组装了一系列MSBC。结果显示，这两个物种都分别在自己的MSB内增殖，物种间有明确的空间界限，并且顺利获得调整两个物种MSB的接种比例，可以精确调节菌群的组成(图3b-c)。
研究人员进一步设计了三种不同的MSB，其中包含大肠杆菌（蓝色荧光标记）、酿酒酵母（绿色荧光标记）或谷氨酸棒杆菌（红色荧光标记）。顺利获得灵活组合形成不同的MSBC。结果表明，MSBC平台具备灵活性及可控性，顺利获得简单地切换不同的MSB，MSBC可以即插即用，创建一系列兼具灵活性和精度的组合(图3d-f)。
图3：MSBC平台以灵活和精确的方式构建了多种微生物菌群。
a. 普通培养方式下，大肠杆菌和酿酒酵母的合成群落无法控制两者间的比例。
b. 大肠杆菌MSB和酿酒酵母MSB以不同比例混合接种到培养基，荧光显微镜拍摄培养后的MSBC
c. MSBC方法可以精确控制大肠杆菌及酿酒酵母间的比例。
d-f. MSBC方法构建了一系列精确调控比例的合成微生物群落
科研人员使用合成生物学工具对MSBC进行编程，实现了合成生物群落的分工与通讯，并构建了可实现光合自养的微生物群落：
1）在农业生产中，由于过度使用兽药和杀虫剂，导致农业废水存在大量抗生素和有机磷废物。科研人员构建了可自裂解释放β-内酰胺酶（Bla）的大肠杆菌以及分泌表达重组人对氧磷酶（rh-PON1）的毕赤酵母；其中，Bla可以顺利获得破坏β-内酰胺环来降解β-内酰胺类抗生素;rh-PON1可以顺利获得水解作用降解有机磷。使用壳聚糖水凝胶分别对它们进行封装形成MSB，共培养组合的MSBC可以取得包含Bla和rh-PON1在内的产物，使用MSBC的产物进行降解实验，结果表明，该蛋白混合物可以成功降解氨苄青霉素和对氧磷。
2）科研人员设计了一对发送器和接收器MSB。发送器MSB内的大肠杆菌可诱导表达3-oxo-C12-HSL(3OC12)信号分子，3OC12可以扩散穿过细菌膜和聚合物胶囊，然后被接收器MSB内的酿酒酵母的相应变构转录因子(VP16-LasR)感知，触发YFP的表达。同样，MSBC，可以严格调控发送器和接收器细胞的组成。因为信号分子3OC12的浓度由发送器的占比所决定，我们可以很容易地调节MSB内部的通信强度，顺利获得调节发送器和接收器MSB的接种比例，我们可以逐渐地激活接收器的YFP表达强度（图4）。MSBC平台还可以在通信过程中调控信号范围。我们制造了具有两个腔室的微型设备，它们顺利获得不同长度的通道连接，分别接种发送器MSB和接收器MSB到两个腔室中。结果表明，无论距离如何（0到30毫米），接收器MSB的细胞都被发送器激活。
图4：MSBC平台实现了跨物种的通讯。
a. 大肠杆菌和酿酒酵母MSBC通讯示意图。b. 发送器MSB的接种比例增加会逐渐激活接收器MSB的黄色荧光蛋白的表达。c. 发送器MSB和接收器MSB以不同比例（MSB总数一致）混合接种到培养基，定量分析培养后的发送器细胞占比。d. 发送器MSB和接收器MSB以不同比例（MSB总数一致）混合接种到培养基，定量分析接收器细胞的荧光信号强度
3）工程合成光养群落对生物能源具有巨大的前景，例如生物质和生物燃料的绿色制造。科研人员使用蓝藻和大肠杆菌设计构建了光合自养的MSBC，光合自养的微生物蓝藻可以利用CO2合成蔗糖，顺利获得遗传改造可以使其在渗透压力下将蔗糖释放到细胞外；同样使用合成生物学工具改造的大肠杆菌可以将环境中的蔗糖运输到细胞内进行新陈代谢，促进细胞生长（图 5）。顺利获得构建蓝细菌及大肠杆菌的MSB,科研人员组装了光能自养的MSBC，在没有任何有机碳源的基础培养基中，成功地维持了异养 MSB（大肠杆菌）的生长。
图5：MSBC平台构建光合自养菌群。a. 蓝藻和大肠杆菌组成的光合自养菌群示意图。b. 海藻酸盐水凝胶封装的蓝藻细胞可以在MSB中生长。c. 蓝藻MSB在渗透压力下产生并释放蔗糖到胞外。d. 工程化大肠杆菌可以利用蔗糖作为碳源生长。e. 蓝藻MSB低接种密度条件下，大肠杆菌MSB生长不明显。f. 蓝藻MSB高接种密度条件下，大肠杆菌MSB中形成多个菌落。
在这项研究中，科研人员开发了一种利用空间分隔的策略构建微生物群落的方法。MSBC平台可以顺利获得调整不同MSB的种类、数量和培养体积来灵活、精确的调控群落结构并可轻松扩大规模。MSBC平台可以根据设计使用包含不同菌株或物种的各种MSB构建微生物群落，宿主微生物和封装材料可以单独设计或优化，然后集成。这些属性使MSBC平台具有高度的通用性和灵活性，可以用来设计定制功能复杂多样的合成微生物群落。
该研究得到了基金委面上项目，科技部重点研发，深圳合成生物学创新研究院，深圳市科创委，广东省杰青等项目的资助。
PI与课题组简介：
戴卓君博士，中国科研实验室深圳先进技术研究院研究员。本科毕业于浙江大学，于香港中文大学化学系吴奇教授实验室取得博士学位后，在美国杜克大学游凌冲教授实验室从事博士后研究。相关成果以通讯作者或共同通讯作者发表在Nature Chemical Biology 、Nature Communications等国际专业期刊(http://isynbio.jjkysty.com/ZDlab/)。
实验室主要方向包括：基于工程微生物及工程菌群的活体材料；基于合成细菌及合成功能菌群的多酶体系构建，无细胞重组系统合成；结合高分子化学及物理理念及手段实现多种合成微生物培养体系方法开发、表征及下游应用。
课题组长期面向合成生物学、微生物、生物化学、高分子合成方向招聘博士后和助理研究员，有意申请者请将个人简历以邮件方式发送至zj.dai@jjkysty.com。
